茯砖茶中活性成分的高通量筛选及功能研究-茶礼仪网

茯砖茶中活性成分的高通量筛选及功能研究

傅冬和

【摘要】：随着全球经济的快速发展，人们生活水平的日益提高，高脂血症及肥胖症的患病率不断上升，且已成为摆在人们面前的首要健康问题。肥胖症及高脂血症的预防和治疗是当今全球健康产业关注的热点，寻找天然、高效、安全的降脂减肥药物或保健食品是全球科技领域和产业领域十分关注的课题。茶为药用历史悠久，随着现代科学技术的进步和对茶叶药理功能研究的深入，业已证明茶叶具有降血脂、抗动脉粥样硬化等多种药理功能。湖南是我国茯砖茶的主产区，茯砖茶是边疆少数民族同胞经历多年选择的、日不可缺的必备饮品。本研究采用现代分离纯化技术逐级深入分离茯砖茶的有效成分，同步采用高通量筛选、代谢酶活性测试及动物试验，系统地研究茯砖茶的降脂减肥功效，获得了如下研究成果： 1．茯砖茶功能成分分离及结构鉴定将现代分离技术与高通量药物筛选技术相结合，分离和确定茯砖茶的主要活性成分，首次从茯砖茶中分离得到8个单体化合物。通过综合运用红外、紫外、质谱、核磁共振、高效薄层及高效液相色谱等分析技术，确定此8个化合物分别为：没食子酸、没食子儿茶素(GC)、3-甲氧基-4，5-二羟基苯甲酸、3，4-二羟基苯甲酸、表没食子酸儿茶素(EGC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)及芦丁。 2．茯砖茶降脂减肥功效的高通量筛选与动物试验本研究首次运用高通量药物筛选技术研究了茯砖茶水提物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后所得各萃取部分及茶渣醇提物对与降脂减肥作用相关的PPARα、PPARσ、PPARγ、LXR、FXR及3T3-L1模型的作用效果。结果表明，所有样品对3T3-L1细胞的抑制作用及对PPARα模型的激活作用不明显，而对FXR模型都有激活作用。乙醇提取物对FXR模型的激活效果最好，激活倍数达2.313，其次是乙酸乙酯萃取层，激活倍数达2.083，激活作用都相当显著；水层对FXR模型的抑制作用最明显，其次是正丁醇萃取层。正丁醇萃取层对LXR模型有激活作用。三氯甲烷萃取层及水层样品对PPAR7有一定的激活作用；综合效果最好的是乙酸乙酯萃取层，对PPAR8、PARγ、LXR及FXR模型均有较强的激活作用，且激活倍数均在1.80以上。对从茯砖茶乙酸乙酯萃取部分分离制备的5个单体化合物进行高通量药物筛选研究，结果表明，EGCG的两种初筛浓度对FXR模型的激活作用均较强，特别是50μg／mL的初筛浓度时，其激活倍数达6.000；ECG在50μg／mL的初筛浓度下作用很明显，达3.220。没食子儿茶素对FXR激活模型、PPARδ及γ模型、LXR模型均有效果，对PPARγ模型的激活倍数达1.619。3-甲氧基-4，5-二羟基苯甲酸对FXR抑制模型、PPARγ模型、LXR模型均有效果，对PPARγ模型的激活倍数达1.734。3，4-二羟基苯甲酸对FXR模型的抑制值为3.641，明显小于对照CDCA的抑制值6.435，因此其对抑制模型的作用非常明显。以上研究结果说明这几个化合物均为茯砖茶的活性成分。以0.085、0.170、0.510 g／kg·bw剂量的茯砖茶提取物给大鼠灌胃30d，与高脂对照比较，0．170g／kg·bw剂量可显著降低高脂饲料大鼠血清TC、TG水平(P＜0．01)，各剂量对大鼠血清HDL水平无显著影响(P＞0．05)。 3．茯砖茶降脂减肥的作用机理茯砖茶通过激活PPARδ以激活靶基因，使体型变瘦并改善血脂状况，延缓动脉粥样硬化的发展，有效逆转动脉粥样硬化损伤时泡沫细胞中的胆固醇沉积。茯砖茶激活PPARγ调节脂肪细胞信号转导的作用，诱导脂肪细胞特异性基因的产生，减少与代谢综合症相关的心血管疾病的发生；使骨骼肌中脂肪酸分解代谢增加。茯砖茶通过激活LXR的活性，增加胆固醇从肝中排出，减少小肠对胆固醇的吸收，从而调节血脂的水平，并调节脂蛋白代谢。茯砖茶一方面通过激活FXR模型增加极低密度脂蛋白(VLDL)和乳糜微粒(CM)中的甘油三酯的水解，降低VLDL和低密度脂蛋白(LDL)的水平，增加高密度脂蛋白(HDL)的合成，减少血．浆中甘油三酯的水平；另一方面，通过抑制FXR模型，促进肝中胆固醇分解成胆汁酸排泄到小肠中并排出体外，降低血液中胆固醇的含量，从而起到降血脂的功效。茯砖茶提取物依次用三氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取后，所得样品对胰脂肪酶活性的影响程度不同，三氯甲烷萃取层稍有抑制作用，水提物、乙酸乙酯萃取层及正丁醇萃取层有较明显的激活作用，正丁醇萃取层部分激活作用最明显，达2.54倍。茯砖茶各部分对α-淀粉酶活性均有激活作用，其中以乙酸乙酯萃取部位的激活作用最强，激活倍数为对照的4.09倍，其次是水提物，其激活倍数为对照的2.99倍；水层的激活作用最弱，其激活倍数为1.20倍；三氯甲烷萃取层稍有抑制作用。乙酸乙酯及正丁醇萃取层部分经过HP-20树脂再分离后，各部分仍有较高的活性。 4．茯砖茶加工过程中主要化学成分的变化规律茯砖茶由于发花工序而形成完全不同于黑毛茶的品质特征。茯砖茶加工过程中几种主要化学成分含量变化的测定结果表明，各种化学成分均有不同程度的减少，其中儿茶素、黄酮类及茶多酚总量减少最多，分别减少了63.64％、51.52％、54.62％，氨基酸下降36.84％，咖啡碱下降10.85％，可溶性糖及水浸出物变化不大。“发花”工序是各成分含量下降最快的环节，由于有大量冠突散囊菌等微生物的参与及适度的湿热作用使化学成分发生变化，从而形成了茯砖茶独特的品质。 5．动物试验证明茯砖茶无毒通过周密的试验设计研究了茯砖茶的毒理作用，结果表明茯砖茶对雄性小鼠的急性经口LD_(50)为14700 mg／kg·bw，对雌性小鼠的急性经口LD_(50)为19600 mg／kg·bw(95％可信限为10600-36000)，Ames及致小鼠精子畸形试验均为阴性。以0.85％、1.25％、1.70％的茯砖茶提取物掺入饲料中喂饲大鼠30d，试验期间，各组动物生长发育良好。雌鼠血清胆固醇及1.25％、1.70％剂量组的血清谷丙转氨酶均显著低于对照组(P＜0.05或P＜0.01)，样品0.85％剂量对肝／体比值虽显著升高，但无生物学意义。各剂量组对雌雄鼠血像、雄鼠血生化各项、甘油三酯、尿素酐、血肌酐、血糖和雌雄鼠脾／体、肾／体比值、组织病理无显著影响(P＜0.05)。毒性试验综合结果证明，茯砖茶样品30d喂养对雌雄大鼠无明显毒副作用，茯砖茶属实际无毒级。

【关键词】：茯砖茶降脂减肥高通量药物筛选分离纯化结构鉴定

【学位授予单位】：湖南农业大学

【学位级别】：博士

【学位授予年份】：2007

【分类号】：S571.1

【DOI】：CNKI:CDMD:1.2007.208186

【目录】：

中文摘要8-11

英文摘要11-15

第一章绪论15-28

1 国内外研究进展15-25

1.1 肥胖产生的原因及危害15-16

1.2 高血脂症产生的原因及危害16

1.3 茶叶降脂减肥的研究进展16-20

1.4 茯砖茶研究进展20-21

1.5 高通量筛选在天然产物开发中的作用及相关模型的研究进展21-25

2 研究的目的和意义25-26

3 研究内容及关键技术26-28

3.1 研究内容26-27

3.2 关键技术27-28

第二章茯砖茶活性成分的分离鉴定28-54

1 材料与方法28-32

1.1 材料28

1.2 仪器及试剂28-29

1.3 技术路线29

1.4 方法29-32

2 结果与分析32-53

2.1 吸附树脂的优选32-34

2.2 茯砖茶乙酸乙酯萃取层部分活性成分分离34-36

2.3 正丁醇萃取层部分活性成分分离36

2.4 单体化合物类别判断36-37

2.5 单体成分结构鉴定37-53

3 讨论53-54

第三章茯砖茶降脂减肥功效的高通量筛选研究54-70

1 材料及方法54-59

1.1 材料54

1.2 技术路线54-55

1.3 方法55-59

2 结果与分析59-66

2.1 茯砖茶对PPARs、LXR、3T3-L1模型的作用59-63

2.2 茯砖茶对FXR模型的作用63-64

2.3 茯砖茶功能成分单体的高通量筛选研究64-66

3 讨论66-70

3.1 高通量筛选方法是茯砖茶降脂减肥功效研究的快速、准确的方法66-67

3.2 茯砖茶降脂减肥机理探讨67-68

3.3 茯砖茶更多的降脂活性成分有待进一步研究68-70

第四章茯砖茶对代谢酶活性的影响70-76

1 材料和方法70-71

1.1 材料70

1.2 主要仪器设备70

1.3 样品制备及内含成分含量测定70

1.4 酶活检测方法70-71

2 结果与分析71-74

2.1 茯砖茶不同部位主要有效成分分析71-72

2.2 茯砖茶各部分对α-淀粉酶活性的影响72-73

2.3 茯砖茶各部分对胰脂肪酶活性的影响73-74

3 讨论74-76

3.1 茯砖茶有利于提高α-淀粉酶的活性74

3.2 茯砖茶对脂肪酶有激活作用74-75

3.3 茯砖茶是游牧民族的首选饮料75-76

第五章茯砖茶加工过程中主要化学成分的变化76-82

1 材料和方法76-77

1.1 材料与设备76

1.2 取样76

1.3 主要生化成分的分析方法76-77

2 结果与分析77-79

2.1 茯砖茶制造过程中几种主要内含成分含量的变化77-78

2.2 茯砖茶制造过程中儿茶素各组分含量的变化78-79

3 讨论79-82

3.1 茯砖茶加工过程中儿茶素下降是多种因素综合作用的结果79-80

3.2 氨基酸是茯砖茶香气滋味物质形成的重要前体80

3.3 咖啡碱及可溶性糖类物质的变化是茯砖茶滋味醇和的重要原因80-81

3.4 茯砖茶各内含成分协调变化的结果是其品质形成的生化基础81-82

第六章茯砖茶降血脂功效及毒理的动物试验82-92

1 材料与方法82-84

1.1 样品82

1.2 试验动物82

1.3 试验环境条件82

1.4 剂量选择82

1.5 主要仪器与试剂82-83

1.6 高脂饲料83

1.7 检测方法83-84

1.8 检验依据84

1.9 试验数据统计84

2 结果与分析84-91

2.1 降血脂作用84-86

2.2 茯茶对小鼠的毒理试验86-88

2.3 茯茶对大鼠的毒理试验88-91

3 结论91-92

3.1 茯砖茶可以开发成高脂血症的治疗药物或保健品91

3.2 茯砖茶是安全饮料91-92

全文结论92-96

创新点96-97

展望97-98

参考文献98-106

附图106-129

缩写词129-130

致谢130-131

作者简介131

本文系湖南农业大学博士论文，论文全部内容请到相应学术机构咨询购买，中国黑茶网不提供全文阅读！

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夏季喝黑茶既消暑解渴又祛热

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