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茶多酚氧化酶酶学性质研究

赵淑娟王坤波傅冬和李园莉雷玉国李勤

(湖南农业大学a园艺园林学院;b.茶学教育部重点实验室，湖南长沙410128)

(本文系学术论文，仅供中国黑茶论坛广大茶友交流学习之用，未经原作者或相关机构许可严禁用于商业等其他用途，违者后果自负)

摘要:采用柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(PHS.6)匀浆浸提法和硫酸馁沉淀法，从茶鲜叶中提取多酚氧化酶，并通过分光光度法研究pH，温度，抑制剂对酶活性的影响.结果表明:以邻苯二酚为底物，茶多酚氧化酶PPo的最适pH为5.6，最适温度为50℃，亚硫酸钠、半胧氨酸和v-c为Po的抑制剂.关键词:茶;多酚氧化酶;抑制剂

中图分类号:5571.101 文献标识码:A

0n th ee nzymologlcalfeatureofPolyPhenol0x1dase fromtea

Abstract:lyPhenoloxidase(PPO)wasextractedfromtealeaveswithsodiumPhosPhate bufer(PHS.6)fractionatedwithsolida。oniumsulfate.SpectroPhotometer methodwasaPP1iedinthe experimenttostudythe charactorsofPP0fromtea，suchasProperPH，timumtemperatureandinhibitors.Theresultsshowedthatwhen catecholwasusedasenzymesubstrates，theProPerPHwass.6，the oPtimumtemperaturewas50℃，ascorbicacid，sodiumsulfite，L一cysteine，benzoic即idandcinnamicacidwere nhibitorsofP0fromtea.Diferentsubstrateshad

diferen tefectsonPP0activity.

Keywords:tea;polyPhenoloxidase;inhibitor

茶多酚氧化酶(邻苯二酚氧化还原酶，po，E.c.1.10:31)是茶树体内的一种重要酶类，它对茶树的生长发育具有积极意义，在茶叶加工中占有极为重要的地位，其活性的高低也是决定茶树品种适制性的一个重要指标1].在茶叶加工过程中，茶多酚氧化酶的作用主要是促使儿茶素类物质氧化成邻酿进而形成茶黄素等氧化聚合物12].伴随着儿茶素等多酚类物质的氧化，氨基酸、胡萝卜素等香气前体物质发生偶联氧化，产生多种香气化合物，形成红茶的独特品质.有研究证明，茶黄素含量与红茶品质呈高度正相关，并具有良好的生理活性131.近代研究表明，茶黄素具有抑菌、抗炎、抗病毒、抗氧化、降脂等多种药理功能，并对动脉粥样硬化、高血压、龋齿等都有一定的防治效果叫].研究茶多酚氧化酶的生物学特性，是茶叶生化领域的一大热点.掌握多酚氧化酶的特性，可以为红茶加工过程中控制适度发酵及提高茶黄素的含量提供理论依据，丰富茶叶加工及生物化学理论.

1 材料与方法

1.1 材料

茶鲜叶储叶齐，采于长沙高桥茶园，储藏于一70℃冰柜中.

1.2 方法

1.2.I PPO的提取

取 50 9，一70 ℃茶鲜叶加人到30mL预冷的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液(PHS.6)中，并加人109Pvpp和0.59琴c，在组织粉碎机中匀浆2次，每次2而n.匀浆物收集于大三角瓶中，于4℃冰箱中，静置浸提12h，其间振荡2次.将浸提后的酶液经4层纱布过滤后，在冷冻离心机中以4℃离心2次，每次20而n，转速分别为40(刃和9。叹川min，弃去沉淀，边搅拌边向上清液中加人固体硫酸按分级盐析，取30%一80%盐析沉淀物经pHS.6的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲液透析，即得到茶多酚氧化酶粗酶液.

1.2.Z PO活性测定及最佳反应条件的确定于3 7 ，C ，pHS.6的条件下，用U琴2550分光光度计在460nm 波长下检测酶活，单位时间内，单位体积酶液吸收值变化0.01定义为一个酶活单位.配制。。l mo讥柠檬酸磷酸缓冲液，在pH分别为4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0时，以rolnm o比邻苯二酚为底物测定多酚氧化酶的活性.配制 0 .lm 。比pHS.6的柠檬酸磷酸缓冲液，分别在25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80℃条件下，以10Inlno 比邻苯二酚为底物，测定多酚氧化酶的活性.以 10 Inln o比邻苯二酚为底物，在上述检测的最适pH及最适温度的条件下测定亚硫酸钠、半胧

氨酸和丫C对多酚氧化酶活性的影响.配制 10 rnJllo比邻苯二酚，50Inm o比焦性没食子酸，Zmo ljLEGcg，Zrnm o比ECg，再用pH5.6的柠檬酸磷酸缓冲液调配成不同终浓度水平，测定米氏常数角n和最大反应速率竹nax.

2 结果与分析

2.l pH对pPO活性的影响

以邻苯二酚为底物，于37 ℃条件下测定不同pH值时多酚氧化酶的活性，结果见图1.从图1可以看出，以邻苯二酚为底物，茶鲜叶中多酚氧化酶的最适pH约为5.6.当pH降至4.0时，酶活性为最高活性的68.5%;当pH升至8.0时，酶活性为最高活性的35.8%.毛清黎10]在研究红茶发酵中pH调控对多酚氧化酶活性及茶黄素形成的影响时，也发现在偏酸的条件下发酵有利于茶黄素的形成从而提高红茶品质.

图略

2.2 温度对ppo活性的影响

以邻苯二酚为底物，pHS.6条件下测定不同温度对多酚氧化酶活性的影响，结果如图2.茶多酚氧化酶对温度很敏感，其最适温度为50 ℃.温度比最适温度低时，随着温度的升高，酶活性也升高，直至最适温度才表现最大活力，但是温度高于最适温度以上时酶活性呈直线下降，温度升至80℃时，茶多酚氧化酶的活性完全受到抑制.所以，调节反应温度可以有效提高多酚氧化酶活性.

图略

2.3 亚硫酸钠、半肤氨酸和V一C对pPO活性的影响底物为 ro lnln o比邻苯二酚，在37℃，pHS.6时测定不同添加剂对多酚氧化酶的抑制作用，结果见图3，亚硫酸钠、半胧氨酸和v一C都对茶叶中的多酚氧化酶有强烈的抑制作用.当V一C浓度达到0.Znuno 比，N屯503浓度达到。，3nlnoUL，半胧氨酸浓度达到0.4Inln o比，均能完全抑制茶多酚氧化酶的活性.

图略

.4 不同底物对PO活性的影响

以不同底物测定酶促反应的动力学性质.根据中间复合物假说，在pHS.6，37℃条件下，测定了不同底物存在时的吸光值，采用Lineweaver-Burk双倒数法求得各底物的为n和Vhlax，结果见表1.

图略

从以上结果中可以看出，不同底物对茶多酚氧化酶的催化反应有不同的尤由和竹nax .4个底物中，茶多酚氧化酶的最佳底物是Ecg，其次是EGCg，焦性没食子酸和儿茶酚.但从反应速度来讲，儿茶酚的Vmax最大，其余大小依次是儿茶酚，Ecg，Eocg，焦性没食子酸.

3 讨论

PPO 是一种含铜的蛋白质，其作用机制在于铜的氧化还原作用，在酸性环境中，酶中cu2+被解离出来，使酶失活，而在碱性环境中酶蛋白与cu2+脱离成为不溶性氢氧化铜，也能使酶失活fl‘].本试验以邻苯二酚为底物，茶鲜叶中多酚氧化酶的最适pH约为5.6.不处于最适pH条件下时，PPO都不能充分发挥其催化作用.因此，控制适宜的pH值能有效提高酶活性，有利于酶促反应的进行.同时，儿茶素的组成和温度等条件也对酶促反应影响较大，

参考文献:

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安化黑茶综合产值7年增长近百倍

因为保健养生功能的发现，安化黑茶一夜成名，在茶市迅速崛起。

记者翻看历史数据发现，在7年时间内，安化黑茶的综合产值增长了近百倍。在2007年的时候，安化黑茶的年产值还不足1亿元，到了2014年的时候，安化黑茶的年产值已经近80亿元。

安化黑茶的实体店在这7年时间内遍地开花，8月17日，记者在安桥茶叶城和神龙茶叶城看到，安化黑茶的门店众多，品牌众多，成为茶业市场的主角。

日前，“第三届中国湖南·安化黑茶文化节”新闻发布会召开，10月22日至25日将在安化举行，届时将有超过8000名境内外嘉宾参会。

湖南省茶业协会副秘书长黄德开表示，近年来，安化黑茶产业飞速发展，目前仍处于上升期，价格仍保持每年10%以上的增长速度。

安化黑茶综合产值7年增长近百倍

说起黑茶，黄德开充满感情，来自安化本地，从小与黑茶打交道。

在2007年以前，安化黑茶主要作为边销茶生产，价格低廉，外界也嫌弃它带点土壤气息的味道。公开数据显示，2006年，安化黑茶的年总产值还不足5000万元，黑茶产业是一个老产业但是却毫无生气，年轻人都宁愿外出打工也不愿意在家种茶。

2007年安化县发布了《关于做大做强茶叶产业的意见》1号文件。2008年8月又出台了《关于做大做强茶叶产业的意见的实施细则》。安化黑茶从此开始走上正轨。2008年，安化全县黑茶产量9870吨、产值1.56亿元，实现大突破。

尤其是随着安化黑茶“金花菌”养生保健功效的发现，使得安化黑茶迅速起飞。来自安化县政府的数据显示，2014年，安化黑茶茶叶加工量4.95万吨，茶产业综合产值78亿元，获得“2014年度中国茶产业十大转型升级示范县”和“中华生态文明茶乡”称号，稳居全国重点产茶县十强，连续两年全国综合排名第三，黑茶产量位列全国第一。

从2007年的综合产值不足1亿元到年产值近80亿元，在7年时间内，安化黑茶的综合产值增长近百倍。

安化黑茶成为湘茶的名片

湖南提出打造千亿茶产业，安化黑茶是重要的力量。日前，安化黑茶已经成为湘茶的一张名片。

日前，深圳茶人夏先生前往安化县进行茶叶考察，夏先生告诉记者，在深圳，安化黑茶市场这几年发展迅速，在茶友圈，只要提到湖南茶叶，必然想到安化黑茶，安化黑茶的市场表现很不错。目前，安化黑茶已成功进入北京、广州、上海、武汉、深圳等46个大中城市，远销蒙古、日本、俄罗斯、韩国、德国及香港、台湾等国家和地区。据不完全统计，安化黑茶专卖实体店达3000家以上，网店达3万多家。

2008年，安化千两茶和茯砖茶的制作技艺列入第二批国家非物质文化遗产保护名录;2009年，安化黑茶成为国家地理标志保护产品;2010年，安化黑茶入选上海世博十大名茶和湖南省十大茶品牌;2011年，安化黑茶被评为中国最具带动力的茶叶区域公用品牌。在2015米兰世博会名茶评选中，安化黑茶获得中国名茶称号。

日前，湖南省政府举行新闻发布会，“第三届中国湖南·安化黑茶文化节”将于10月22日至25日在安化举行，届时将有超过8000名境内外嘉宾参会。

黑茶越陈越香

据了解，黑茶属全发酵茶，因成品茶的外观呈黑色而得名，是六大茶类之一，湖南为主产区之一。

黑茶一大特点是对人体具有保健功效，其中的茶氨酸等具有良好的增强人体免疫力的功能，另外还有美容、治疗皮肤性疾病(能防止皮肤上黑色素的沉淀)、提神醒脑、促进消化、治痢疾、醒酒、提高免疫力、降血脂等作用，老少皆宜。说起黑茶的优点，不少业内人士都能罗列出一大串。据介绍，黑茶与普洱茶一样，对人体降脂降糖有显效，并具有越陈越香的特质，被称为“能喝的古董”。

冬季最适合饮用陈年黑茶

咱们湖南安化的黑茶跟绿茶相比，少了绿茶的清淡的口感，红茶相比呢，又没有红茶的艳丽的色泽，但是安化的黑茶还是受到大家的喜欢，这是为什么呢?那就是因为黑茶的独特的功效，下面我们就来看看黑茶的功效是什么吧。

陈茶叶的功效与作用都有什么?以陈黑茶为例来给大家说说，黑茶富含有人体所需的氨基酸等有益物质，所以其养生功效备受人们肯定。陈年黑茶有什么样的特点呢?1.汤色红艳明净，无浑浊，犹如陈年的洋酒，极具观赏价值，宜用玻璃器皿冲泡，便于观色。2.滋味：初泡味厚而不腻，回味略偏酸。中期甜纯带爽，入口即化。后期即使汤色变浅，茶味仍觉甜纯并且无杂味。

黑茶讲究用滚水冲泡。可以用紫砂壶、盖碗、瓷壶来泡，最好用铸铁壶烧水。因为铸铁壶可以把水烧到100度，有利于泡出黑茶的味道。冲泡时，取适量茶投入壶中先洗后煮。第一泡茶，浸泡时间30秒至1分钟，第二泡20秒即可，可冲泡数次。老茶是十分的耐泡，陈年茶品一般可冲泡十次以上。当然随着陈年黑茶的保健的功效发现，陈年黑茶的身价也不断的水涨船高，一些不法的商家也瞧准了其中的暴利，以新的黑茶来冒充陈年的黑茶进行销售，所以消费者们再选购的时候一定要留心一些哦。

关于黑茶的内容小编就介绍到这里了，在黑茶的冲泡上，那么作为茶客来说，品茗这道集合天地灵气的茶品，一定不能操之过急，在冲泡黑茶的时候一定要耐心的等待，方才能品出其中的美妙滋味哦。

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